Komplemento fiksavimo reakcija(RSC) yra sudėtinga dviejų pakopų serologinė reakcija. Jame naudojami penki ingredientai, sudarantys dvi sistemas: antigenas, antikūnas, komplementas (pirmoji sistema); avių eritrocitai, įjautrinti (gydomi) hemoliziniu serumu, turinčiu jiems specifinių antikūnų (antroji, arba indikatorinė, hemo sistema). Šiuo atveju antikūno sąveika su antigenu pirmoje reakcijos stadijoje sukelia imuninio komplekso, kuris adsorbuoja komplementą, susidarymą, tačiau to neįmanoma aptikti vizualiai. Antrame etape hemo sistema naudojama kaip komplemento fiksacijos indikatorius ant antigeno-antikūno komplekso, kuris, būdamas imuninis kompleksas, taip pat gali jį adsorbuoti. Galiausiai yra dvi galimos reakcijos pasekmės. Jei antikūnas ir antigenas atitinka vienas kitą, o susidaręs kompleksas adsorbuoja komplementą, hemo sistemos eritrocitų lizė neįvyks. Jei antikūnas nesutampa su antigenu ir atvirkščiai, likęs laisvas komplementas prisijungs prie hemo sistemos ir sukels hemolizę.

Kaip ir kiti serologiniai tyrimai, RSA gali būti naudojamas aptikti specifinius antikūnus iš žinomo antigeno arba aptikti antigeną iš žinomų antikūnų.

bendrosios charakteristikos RSK ingredientai.

1. Prieš atliekant reakciją, tiriamas SERUMAS kaitinamas vandens vonioje 30 minučių, kad inaktyvuotų savo komplementą, ir skiedžiamas nuo 1:5.

2. ANTIGENU gali būti bakterijų kultūros, jų lizatai, virusai ir virusų turinčios medžiagos, patologiškai pakitusių organų ir audinių lipidų ekstraktai.

3. KOMPLEMENTAS – eksperimento dieną gautas jūrų kiaulytės serumas. Šiuo metu naudojamas pramoninis sausas priedas.

4. HEMOLITINĖ SISTEMA susideda iš hemolizinio serumo ir 3% avies raudonųjų kraujo kūnelių suspensijos, sumaišytos vienodais tūriais. Norint įjautrinti eritrocitus hemolizinais, mišinys 30 minučių laikomas termostate 37°C temperatūroje.

Pagrindinio RSC eksperimento nustatymas. SERUMAS, ANTIGENAS IR KOMPLEMENTAS pilamas į 1 mėgintuvėlį, serumas, komplementas ir vietoj antigeno į antrąjį mėgintuvėlį pilamas izotoninis natrio chlorido tirpalas (SERUMO KONTROLĖ), į trečią mėgintuvėlį pilamas antigenas, komplementas ir tas pats natrio chlorido tirpalas ( ANTIGENŲ KONTROLĖ). Mėgintuvėliai 1 valandai dedami į 37°C temperatūros termostatą. Tuo pačiu metu paruošiama hemolizinė sistema, kuri, nuėmus stovą nuo termostato, pridedama prie visų trijų vamzdelių. Sumaišius brangakmenių sistemą su trijų mėgintuvėlių ingredientais, pastarieji vėl dedami į termostatą 1 valandai, o po šio laiko atsižvelgiama į RSK rezultatus.

Atsižvelgiant į RSC, reakcijos intensyvumas nurodomas pliusais: „++++“ – smarkiai teigiama reakcija visiškai vėluojant hemolizei, skystis mėgintuvėlyje yra bespalvis, visi raudonieji kraujo kūneliai nusėdo apačioje; „+++“, „++“ – teigiama reakcija, kuriai būdingas skysčio spalvos padidėjimas dėl hemolizės ir raudonųjų kraujo kūnelių skaičiaus sumažėjimas nuosėdose; „+“ – silpnai teigiama reakcija, skystis yra intensyvios spalvos, vamzdelio apačioje yra nedidelis kiekis raudonųjų kraujo kūnelių. Neigiamą reakciją rodo „–“ ženklas, kuriame stebima visiška hemolizė, skystis mėgintuvėlyje yra intensyviai rausvos spalvos („lako kraujas“).

RSC yra labai sudėtinga, bet labai jautri specifinė reakcija. Plačiai naudojamas sifiliui diagnozuoti, lėtinė forma gonorėja, kokliušas, aktinomikozė, visos riketsiozės ir virusinės infekcijos.

Susietas imunosorbento tyrimas.

Metodą aštuntojo dešimtmečio pradžioje nepriklausomai viena nuo kitos sukūrė trys mokslininkų grupės. Metodas panašus į RIA, tačiau jis pagrįstas Ag arba Ab, kuris patenka į reakciją su fermentu, žymėjimu. Etiketės judėjimą su substratu dažniausiai lydi terpės spalvos pasikeitimas. Šiuo metu yra sukurta daugybė šio metodo modifikacijų, tačiau plačiausiai naudojamas heterogeninis kietosios fazės ELISA (kietos fazės). Yra:

1) TIESIOGINĖ KIETOS FAZĖS ELISA. Tokiu atveju:

1. serumas su Ab inkubuojamas su Ag, fiksuotu ant kieto substrato (dažniausiai tai yra plastikinė mikroplokštelė).

2. Abs, kurie nesurišo Ag, pašalinami pakartotinai plaunant.

3. Į Abs, kurie surišo Ag, pridedamas fermentu pažymėtas serumas.

4. Nustatykite žymenų fermentų, susietų su At, skaičių.

2) KONKURENCINGA KIETOS FAZĖS ELISA.

1. Įpilkite išrūgų. Jei jame yra specifinių Abs, tada jie jungiasi su Ags, pritvirtintais ant kieto pagrindo. Jei konkrečių Abs nėra, Ag atrodo nesurištas.

2. Pridedant fiksuotam Ag būdingus antikūnus, pirmuoju atveju jie neturės su kuo sąveikauti (dauguma Ag jau yra susieti) Þ žymeklio kiekis mažas. Antruoju atveju specifiniai Abs prisijungs prie Ag ir skalbimo metu jie nebus nuplauti Þ didelis žymenų kiekis.

Panašus į m.b. ANTIKŪNAI yra fiksuoti, o įvairios įmonės gamina tabletes su jau fiksuotais antikūnais.

Palyginti su klasikiniais Ag aptikimo metodais, šis metodas leidžia tiesiogiai įrašyti jų sąveiką su Ab, o ne antrines apraiškas (agliutinaciją, kritulius ar hemolizę). Metodas labai JAUTRUS (pakanka 1ng/ml koncentracijos).

Nustatykite: chlamidijos, klostridijos, ŽIV ir kt.

8. Fagocitozės reakcija.

Fagocitozę vykdo mikrofagai ir makrofagai. Fagocitozės stadijos: priartėjimas, sukibimas, panardinimas, virškinimas.

Fagocitinių ląstelių funkcinio aktyvumo įvertinimas.

Kiekis atliekamas granulocitų ir monocitų fagocitinio aktyvumo vertinimas viso kraujo, leukocitų suspensijoje arba praturtintose fagocitinių ląstelių frakcijose. Standartiniais fagocitozės objektais naudojamos 1,0–2,0 mikronų skersmens monodispersinės latekso dalelės, karščiu žudytų bakterijų suspensija arba į mieles panašius grybus.

Fagocitai sumaišomi su fagocituota medžiaga santykiu 1:10 arba 1:100 ir nuolat maišant inkubuojami 37°C temperatūroje 30 minučių. Tada mėgintuvėliai centrifuguojami, o nuosėdos resuspenduojamos kraujo serumo laše, kad būtų paruoštas tepinėlis. Tepinėliuose, fiksuotuose May-Chrunwald dažu ir nudažytuose pagal Romanovsky-Giemsa metodą, apskaičiuojamas fagocitinių ląstelių procentas (FP – fagocitinis indikatorius) ir absorbuotų dalelių skaičius 1 ląstelėje (PF – fagocitinis skaičius).

U sveikas žmogus FP=40-80%, FP=1-5.

9. Diagnostika.

Diagnostika yra tam tikrų mikrobų ląstelių, nužudytų karščiu arba formalinu, suspensija, kurios ląstelių kiekis tūrio vienete yra žinomas. Gyvų bakterijų suspensijos taip pat gali būti naudojamos kaip antigenas. Reakcijos reiškinys preliminariai pasirodo po dviejų valandų (esant 37 0 C), galutinis rezultatas atsižvelgiama į kambario temperatūrą po 18-20 valandų. Diagnozei teigiamą reakciją domina tik tam tikras serumo titras, kuris yra diagnostinis. Taigi bruceliozės diagnostinis titras yra 1:200, o tula-remia - 1:100. Norėdami aptikti antikūnus, galite atlikti ekspresinius agliutinacijos testus (apskaitos laikas yra kelios minutės). Pavyzdžiui: 1. Kraujo lašelių reakcija sergant tuliaremija. Ant specialios stiklinės paciento viso kraujo lašas užlašinamas lašeliu distiliuoto vandens (skirto hemolizei) ir lašeliu diagnostinės tularemijos. Reakcija įvyksta per 1-2 minutes, aiškiai matomi agliutinatai balkšvų gabalėlių pavidalu. 2. Dėl bruceliozės ant stiklo atliekama ekspresinė Heddelsono agliutinacijos reakcija.

Šios reakcijos neleidžia nustatyti antikūnų kiekio serume b) identifikavimui grynoji kultūra infekcinių ligų sukėlėjai. Šiuo tikslu naudojami imuninės diagnostikos testai.

agliutinuojantys serumai, pagaminti vakcinų ir serumo institutų imunizuojant gyvūnus ištisomis mikrobų ląstelėmis. Serumo autentiškumui užtikrinti geriau naudoti adsorbuotus, kad juose būtų tik tam tikrą mikroorganizmo rūšį ar tipą atitinkantys antikūnai.

Imuninio serumo gavimo principai.

Imuninis serumas (antiserumas) yra kraujo serumas, kuriame yra antikūnų prieš tam tikrą antigeną. Daugeliu atvejų imuniniai (diagnostikos) serumai prieš mikrobų, audinių ir kitus antigenus gaunami eksperimentiniu būdu, imunizuojant gyvūnus atitinkamais antigenais.

Tarp pagrindinių reikalavimų antiserumui yra didelis jų specifiškumas ir pakankamas antikūnų kiekis. Pagal specifiškumą antiserumai išskiriami į polivalentinius (polispecifinius) ir monovalentinius (monospecifinius) antiserumus. Daugiavalenčiuose serumuose yra antikūnų prieš daugelį antigenų, monospecifiniuose – prieš vieną specifinį antigeną. Galite įsigyti monospecifinių serumų:

1) naudojant labai išgrynintus antigenus gyvūnams imunizuoti,

2) natūralių serumų išvalymas nuo nepageidaujamo specifiškumo antikūnų.

Šiam naudojimui:

1) imunoafiniteto metodas, pagrįstas tam tikro specifiškumo antikūnų surišimu atitinkamais antigenais, imobilizuotais ant kietosios fazės nešiklio, po to atskyrimu gautų antigeno-AB kompleksų ir antikūnų išskyrimu;

2) Castellani adsorbcijos metodas. Šiuo tikslu mikroorganizmai, kuriuose yra visų grupių antigenų, paeiliui pridedami prie natūralaus imuninio serumo, kuriame yra grupei specifinių kryžmiškai reaguojančių antikūnų, taip adsorbuojant homologinius antigenus.

kūnai. Tokiuose adsorbuotuose monospecifiniuose antiserumuose yra antikūnų prieš įvairius antigeno molekulės determinantus, kurie yra nevienalyčiai pagal klasę (poklasį).

Komplemento fiksavimo reakcija (CFR) yra ta, kad kai antigenai ir antikūnai atitinka vienas kitą, jie sudaro imuninį kompleksą, prie kurio komplementas (C) yra prijungtas per antikūnų Fc fragmentą, t. y. komplementą jungia antigeno-antikūno kompleksas. Jei antigeno-antikūno kompleksas nesusidaro, komplementas lieka laisvas.

Specifinę AG ir AT sąveiką lydi komplemento adsorbcija (susirišimas). Kadangi komplemento fiksavimo procesas nėra vizualiai akivaizdus, ​​J. Bordet ir O. Zhangu pasiūlė kaip indikatorių naudoti hemolizinę sistemą (avies raudonieji kraujo kūneliai + hemolizinis serumas), parodantį, ar komplementą fiksuoja AG-AT kompleksas. Jei AG ir AT atitinka vienas kitą, t.y. susidarė imuninis kompleksas, tai su šiuo kompleksu susijungia komplementas ir hemolizė nevyksta. Jei AT neatitinka AG, tai kompleksas nesusidaro ir komplementas, likęs laisvas, jungiasi su antrąja sistema ir sukelia hemolizę.

Reakcijos eiga

Reakcija vyksta dviem fazėmis, kuriose dalyvauja dvi sistemos; bakterinė ir hemolizinė. Pirmoji reakcija (specifinė) apima antigeną 4-+ antikūną + komplementą. Teigiamas reakcijos rezultatas, atsirandantis, kai antikūnai sutampa su antigenu, pasižymi specifinio bakterinio antigeno-antikūno komplekso susidarymu su adsorbuotu, arba, kaip sakoma, „surištu“ komplementu. Likęs nematomas, kompleksas nesukelia jokių išoriniai pokyčiai aplinka, kurioje jis susiformavo. Neigiamas RSC rezultatas atsiranda nesant specifinio afiniteto tarp antigeno ir serumo antikūno ir jam būdingas laisvo aktyvaus komplemento išsaugojimas. Pirmoji RSC fazė gali būti atliekama termostate esant 37°C (1-2 val.) arba šaldytuve 3-4°C (18-20 valandų). Ilgai formuojantis antigeno-antikūno imuniniam kompleksui šaltyje, atsiranda pilnesnis komplemento surišimas ir dėl to padidėja reakcijos jautrumas. Atlikdamas lyginamuosius eksperimentus, sovietų imunologas akademikas. V.Ioffe ir jo mokiniai parodė, kad esant ilgalaikei komplemento fiksacijai šaltyje, galima užfiksuoti 100–500 kartų mažesnius antigeno kiekius. teigiamų rezultatų esant didesniam imuninio serumo skiedimui nei komplemento fiksavimo eksperimente 37 ° C temperatūroje 1-2 valandas Antroji reakcijos fazė (indikatorius) vyksta tarp hemolizinės sistemos reagentų (3% suspensijos mišinys). eritrocitai ir hemolizinis serumas vienodais tūriais) 37 °C temperatūroje tik esant komplementui, kuris liko laisvas nuo pirmosios reakcijos fazės (neigiama reakcija). Nesant laisvo aktyvaus komplemento, raudonųjų kraujo kūnelių hemolizė, veikiant specifiniams hemolizinams, nevyksta (reakcija yra teigiama).

Komponentai

Komplemento fiksavimo reakcija (CFR) yra sudėtinga serologinė reakcija. Jai atlikti reikalingi 5 ingredientai, būtent: AG, AT ir komplementas (pirmoji sistema), avių eritrocitai ir hemolizinis serumas (antroji sistema).

CSC antigenu gali būti įvairių nužudytų mikroorganizmų kultūros, jų lizatai, bakterijų komponentai, patologiškai pakitę ir normalūs organai, audinių lipidai, virusai ir virusų turinčios medžiagos.

Šviežios arba sausos išrūgos naudojamos kaip priedas jūrų kiaulytė.

Reakcijos mechanizmas

RSK vykdoma dviem etapais: 1 fazė – mišinio, kuriame yra trys komponentai antigenas + antikūnas + komplementas, inkubavimas; 2 fazė (indikatorius) - laisvo komplemento aptikimas mišinyje, pridedant prie jo hemolizinę sistemą, susidedančią iš avių eritrocitų ir hemolizinio serumo, kuriame yra antikūnų prieš juos. 1-oje reakcijos fazėje, kai susidaro antigeno-antikūno kompleksas, jungiasi komplementas, o vėliau 2-oje fazėje antikūnais įjautrintų eritrocitų hemolizė nevyks; reakcija teigiama. Jei antigenas ir antikūnas nesutampa (tiriamame mėginyje nėra antigeno ar antikūno), komplementas lieka laisvas ir 2-oje fazėje susijungs su eritrocitų – antieritrocitų antikūnų kompleksu, sukeldamas hemolizę; reakcija neigiama.

Taikymas

Komplemento fiksavimo reakcija gali būti naudojama:
1) specifinių antikūnų identifikavimas nežinomame serume, remiantis jų sąveika su žinomo pobūdžio antigenu;
2) tiriant antigeno savybes reaguojant su žinomu specifiniu serumu. Ingredientų paruošimas RSC sustojimui.

1. Tyrimams gautas kraujo serumas reakcijos išvakarėse kaitinamas vandens vonioje 56°C temperatūroje 30 minučių, kad būtų inaktyvuotas jo paties komplementas. Inaktyvuotas serumas gali būti laikomas 3-4°C temperatūroje 5-6 dienas. Eksperimento dieną serumas skiedžiamas izotoniniu natrio chlorido tirpalu santykiu 1:5 (0,1 ml tiriamojo serumo + 0,4 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo).

2. Antigenu CSC gamybai gali būti įvairių mikrobų kultūros, bakterijų baltymai ir ekstraktai, gauti iš mikrobų kultūrų, patologiškai pakitusių ir normalių organų bei audinių. Antigeno paruošimo specifiką lemia infekcinio proceso pobūdis ir jo patogeno savybės.

3. Komplementas yra serumų mišinys, gautas iš 3-5 sveikų jūrų kiaulyčių, arba sausas komplementas ampulėse.

Prieš pat naudojimą jūrų kiaulytės serumas praskiedžiamas izotoniniu natrio chlorido tirpalu santykiu 1:10, kad būtų gautas pradinis tirpalas.

4. Prieš atliekant eksperimentą hemolizinis serumas inaktyvuojamas 30 minučių kaitinant 56 °C temperatūroje. Norint atlikti pagrindinį RSC eksperimentą, taip pat titruoti komplementą ir antigeną, hemolizinis serumas naudojamas trigubu titru. Pavyzdžiui, jei hemolizinio serumo titras yra 1:1800, reakcijoje naudojamas serumo praskiedimas 1:600.

5. Eritrocitai gaunami iš defibrinuoto avies kraujo. Norint pašalinti fibrino plėveles, kraujas filtruojamas per trijų sluoksnių marlės filtrą. Gautas filtratas centrifuguojamas, serumas nusiurbiamas ir nusausinamas, o eritrocitai nuplaunami 3-4 kartus centrifuguojant izotoniniu natrio chlorido tirpalu. Kai raudonieji kraujo kūneliai plaunami paskutinį kartą, ant viršaus esantis skysčio sluoksnis turi būti visiškai skaidrus. 3 % suspensija ruošiama iš išplautų raudonųjų kraujo kūnelių izotoniniame natrio chlorido tirpale. Pirmiau nurodytu būdu paruošę RSC sudedamąsias dalis, titruokite hemolizinį serumą, komplementą ir antigeną.

Ši reakcija naudojama antikūnams aptikti pacientų, sergančių bakterinėmis, virusinėmis, pirmuonių infekcijomis, kraujo serume, taip pat iš pacientų išskirtų virusų identifikavimui ir tipavimui.

RSC reiškia sudėtingas serologines reakcijas, kuriose, be antigeno, antikūno ir komplemento, dalyvauja ir hemolizinė sistema, atskleidžianti reakcijos rezultatus. RSC vyksta dviem fazėmis: pirmoji yra antigeno sąveika su antikūnu dalyvaujant komplementui, o antroji - komplemento surišimo laipsnio nustatymas naudojant hemolizinę sistemą. Šią sistemą sudaro avių raudonieji kraujo kūneliai ir hemolizinis serumas, gautas imunizuojant laboratorinius gyvūnus raudonaisiais kraujo kūneliais. Eritrocitai apdorojami – įjautrinami į juos įpilant serumo 37°C temperatūroje 30 minučių. Įjautrintų avių eritrocitų lizė vyksta tik tada, kai jie prisijungia prie hemolizinio komplemento sistemos. Jei jo nėra, raudonieji kraujo kūneliai nesikeičia. RSC rezultatai priklauso nuo antikūnų buvimo tiriamajame serume. Jei serume yra antikūnų, homologiškų reakcijoje naudojamam antigenui, tada susidaręs antigeno-antikūno kompleksas jungiasi ir suriša komplementą. Pridedant hemolizinę sistemą, šiuo atveju hemolizė neįvyks, nes visas komplementas išleidžiamas specifinei antigeno-antikūno komplekso ryšiai.

Raudonieji kraujo kūneliai išlieka nepakitę, todėl hemolizės nebuvimas mėgintuvėlyje registruojamas kaip teigiamas RBC. Jei serume nėra antigeną atitinkančių antikūnų, specifinis antigeno-antikūno kompleksas nesusidaro ir komplementas lieka laisvas. Kai pridedama hemolizinė sistema, prie jos prisijungia komplementas ir sukelia raudonųjų kraujo kūnelių hemolizę. Raudonųjų kraujo kūnelių sunaikinimas ir jų hemolizė apibūdina neigiamą reakciją.

Norint nustatyti RSC, reikia: paciento serumo, komplemento, hemolizinės sistemos, susidedančios iš avių eritrocitų ir hemolizinio serumo, taip pat izotoninio natrio chlorido tirpalo.

Reakcija atliekama serologiniuose mėgintuvėliuose. Avių raudonieji kraujo kūneliai gaunami iš defibrinuoto avies kraujo, tris kartus plaunant juos izotoniniu natrio chlorido tirpalu. Hemolizinis serumas gaminamas jau paruoštas ampulėse, kurių etiketėje nurodomas jo titras, t.y. maksimalus serumo praskiedimas, kuris vis tiek sukelia hemolizę, kai pridedamas prie raudonųjų kraujo kūnelių, esant komplementui. Hemolizinis serumas gaunamas imunizuojant gyvūnus, pavyzdžiui, triušius, avies raudonaisiais kraujo kūneliais. Nustatant reakciją, serumas naudojamas trigubu titru. Pavyzdžiui, hemolizinio serumo titras yra 1:1200, o darbinis skiedimas 1:400. Kaip komplementas naudojamas šviežias jūrų kiaulytės kraujo serumas (per 24-48 val.) arba sausas komplementas ampulėse.

Prieš atliekant RSC, komplementas praskiedžiamas santykiu 1:10 ir titruojamas, kad būtų nustatytas titras – mažiausias komplemento kiekis, susidarantis hemolizės metu raudoniesiems kraujo kūneliams, kai jis derinamas su šioje reakcijoje naudojama hemolizine sistema. Atsižvelgiant į galimas anti-komplementarines antigeno savybes, atliekant reakciją, nustatytas komplemento darbinis titras padidinamas 20-30%.

RSC antigenas yra nužudytų bakterijų suspensijos, iš šių suspensijų paruošti ekstraktai ir atskiros cheminės mikrobų frakcijos. Pagrindinis reikalavimas antigenui yra komplemento aktyvumo slopinimo nebuvimas. Jis neturėtų turėti papildomų savybių. Norint nustatyti šias antigeno savybes, komplementas papildomai titruojamas dalyvaujant reakcijoje naudojamam antigenui. Yra tam tikros RSC pastatymo schemos. Į reakcijos rezultatus atsižvelgiama atsižvelgiant į raudonųjų kraujo kūnelių hemolizės buvimą ar nebuvimą hemolizinėje sistemoje. RSC naudojamas diagnozuojant sifilį (Wassermann reakcija), gonorėją (Bordet-Gengou reakcija), toksoplazmozę, riketsiją ir virusines ligas.

Komplemento fiksavimo reakcija (CFR)

RSK vykdoma dalyvaujant ne tik AG ir AT, bet ir papildymui. Kadangi nėra matomų pokyčių, komplemento fiksacijai nustatyti naudojama hemolizinė indikatoriaus sistema. Šią sistemą sudaro avių eritrocitai ir triušio hemolizinis serumas. Esant komplementui hemoliziniame serume, įvyksta gerai stebima raudonųjų kraujo kūnelių lizė. Metodo principas yra tas, kad jei eksperimento metu susidaro AG-AT kompleksas ir prie jo prisijungia komplementas (t.y. tirpale nelieka laisvo komplemento), tai raudonųjų kraujo kūnelių lizė nevyks, o raudonasis. kraujo ląstelės nusės ant mėgintuvėlio dugno. Jei kompleksas nesusidaro, komplementas lieka laisvas ir reaguoja su hemolizine sistema, dėl ko lizuojasi raudonieji kraujo kūneliai. Šis mechanizmas yra Wassermann reakcijos (sifilio diagnozės) pagrindas. Bendrą komplemento sistemos aktyvumą vadinamojoje hemolizinėje sistemoje nustato RSC. Hemolizinė sistema yra avių eritrocitų ir standartinio specifinio antiserumo, turinčio antikūnų prieš šiuos eritrocitus, mišinys, tačiau dirbtinai atimtas jo paties komplementas. Tokioje sistemoje eritrocitų hemolizė nevyksta, nes nėra svarbios jungties AT prisijungimo prie AG procese - komplemento, sunaikinto iš anksto kaitinant. Jei prie tokios sistemos pridedamas paciento serumas, kuriame yra komplemento, susidaro imuninis kompleksas, raudonieji kraujo kūneliai sulimpa ir hemolizuojasi. Kuo didesnė komplemento koncentracija tiriamajame serume, tuo ryškesnė eritrocitų hemolizė.

Normalus komplemento kiekis serume yra 20-40 hemolizinių vienetų. Dėl ūmių infekcinių ir uždegiminės ligos Paprastai lėtiniais atvejais padidėja komplemento aktyvumas, jis sumažėja. Mažos hemolizinio aktyvumo reikšmės gali rodyti įgimtą ar įgytą atskirų komplemento sistemos komponentų trūkumą. Reikėtų pažymėti, kad šios sistemos defektai laikomi dažniausiai pasitaikančiomis paveldimomis žmogaus baltymų anomalijomis. Jie gali atlikti patogeninį vaidmenį sergant tokiomis ligomis ir sindromais, kaip:

• pasikartojančios bakterinės pirogeninės kvėpavimo sistemos, odos ir kitų organų infekcijos: pneumonija, bronchektazės, pasikartojantis sinusitas, piodermija, generalizuota bakterinės infekcijos, septicemija;
• pasikartojančios meningokokinės ir gonokokinės infekcijos (meningokokinis meningitas, išplitusios gonokokinės infekcijos, gonokokinis artritas ir kt.);
• autoimuninė, alerginės ligos ir imuninių kompleksų ligos: sisteminė raudonoji vilkligė, dermatomiozitas, membranoproliferacinis glomerulonefritas, Henoch-Schönlein liga, Sjögreno sindromas, trombocitopeninė purpura, sklerodermija, jaunatvinė reumatoidinis artritas, pasikartojanti angioedema (ypač dažnai – laringospazmas), dermatozės, padidėjęs jautrumas šviesai ir kt.

Komplemento fiksavimo reakcija naudojama laboratorinė diagnostika riketsiozė, virusinės infekcijos (gripas, tymai, erkinio encefalito ir tt) ir yra pagrįstas komplemento gebėjimu prisijungti prie AG-AT komplekso. Komplementas adsorbuojamas ant imunoglobulinų O ir M EU fragmento. Reakcija vyksta dviem fazėmis. Pirmasis etapas yra AG ir AT sąveika. Tiriamasis serumas naudojamas kaip antikūnų turinti medžiaga, į kurią pridedamas žinomas antigenas. Į šią sistemą pridedamas standartinis komplementas ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje 1 valandą. Antrasis etapas yra reakcijos rezultatų nustatymas naudojant indikatoriaus hemolizinę sistemą (avies raudonieji kraujo kūneliai ir triušio hemolizinis serumas, turintis hemolizinų į avies raudonuosius kraujo kūnelius). . Į AG-AT komplemento mišinį (1 fazė) pridedama indikatoriaus sistema ir vėl inkubuojama 37 °C temperatūroje 30-60 minučių, po to įvertinami reakcijos rezultatai. Raudonieji kraujo kūneliai sunaikinami, kai jie prisijungia prie hemolizinio komplemento sistemos. Jei komplementas anksčiau buvo adsorbuotas ant AG-AT komplekso, eritrocitų hemolizė nevyksta. Hemolizė įvyksta, kai tiriamajame serume yra specifinių antikūnų prieš diagnostinę hipertenziją. Jei tiriamajame serume nėra specifinių antikūnų, antigeno-ab kompleksas nesusidaro, o komplementas lieka nesurištas. Kai pridedama hemolizinė sistema, prie jos prisijungia komplementas ir įvyksta raudonųjų kraujo kūnelių hemolizė. RSC intensyvumas vertinamas naudojant keturių kryžminę sistemą, atsižvelgiant į hemolizės uždelsimo laipsnį ir eritrocitų nuosėdų buvimą. Visi RSC komponentai, išskyrus tiriamąjį serumą, turi būti titruojami (10.9 pav.).

Ryžiai. 10.9.A- jautrintų eritrocitų lizė esant komplementui: b - hemolizės nebuvimas dėl komplemento fiksacijos AG-AT kompleksu; V- eritrocitų lizė dėl AG-AT komplekso nebuvimo

RSC plačiai naudojami laboratorinei lytiniu keliu plintančių ligų, riketiozės ir virusinių infekcijų diagnostikai. Reakcija vyksta dviem etapais. Pirma fazė- antigeno ir antikūnų sąveika su privalomu komplemento dalyvavimu. Antra- reakcijos rezultatų nustatymas naudojant indikatorinę hemolizinę sistemą (avies raudonuosius kraujo kūnelius ir hemolizinį serumą). Raudonieji kraujo kūneliai sunaikinami hemoliziniu serumu tik tada, kai į hemolizinę sistemą pridedamas komplementas. Jei komplementas anksčiau buvo adsorbuotas ant antigeno-antikūno komplekso, eritrocitų hemolizė nevyksta. Jeigu tiriamajame serume yra antikūnų, papildantis antigeną, susidaręs antigeno-antikūno kompleksas jungiasi (adsorbuoja) prie savęs komplementą. Pridedant hemolizinę sistemą hemolizė nevyksta (uždelsta hemolizė ) , nes visas komplementas išleidžiamas specifiniam antigeno-antikūno komplekso surišimui, o raudonieji kraujo kūneliai lieka nepakitę. Jei serume nėra antikūnų, papildantis antigeną, specifinis antigeno-antikūno kompleksas nesusidaro ir komplementas lieka nesurištas. Todėl, kai pridedama hemolizinė sistema, prie jos prisijungia komplementas. Reakcijos rezultatas šiuo atveju bus hemolizė eritrocitai – mėgintuvėliuose susidaro vadinamasis „lakinis“ kraujas.

Ryžiai. 6. RSK schema: A- indikatoriaus sistema (avies raudonieji kraujo kūneliai ir antikūnai prieš juos), esant komplementui, nustatoma hemolizės forma; b- diagnostinis (Ag) sudaro imuninius kompleksus su paciento serumu ir aktyvina komplementą, todėl hemolizės uždelsimas; V- sveiko žmogaus serume nėra antikūnų, komplementą aktyvuoja indikatorinė sistema, rezultatas – hemolizė.

Reakcijos naudojant pažymėtas at ir ag

Reakcijos naudojant paženklintus antikūnus ir antigenus sudaro greitos infekcinių ligų diagnostikos metodų pagrindą, nes jomis nustatomas minimalus Ag ir Ab kiekis tiriamuosiuose mėginiuose. Kaip etiketes galima naudoti įvairius fermentus, fluorochromo dažus ir izotopus.

Imunofluorescencinė reakcija (RIF) Šis metodas yra greitas ir labai jautrus. Yra dvi jo atmainos. At tiesioginisŠiuo metodu fluorochromu pažymėtas serumas pridedamas prie bandomosios mikrobų suspensijos, pritvirtintos prie stiklo. Gautas antigeno-antikūno kompleksas, apšviestas ultravioletiniais (mėlynai violetiniais) spinduliais, suteikia ryškiai žalias švytėjimas. At netiesioginis RIF naudoja įprastus diagnostinius serumus nuo bet kokio tipo mikrobų. Šio serumo pridėjus į tiriamąją mikrobų suspensiją susidaro antigeno-antikūno kompleksas. Šis kompleksas aptinkamas naudojant universalų fluorescencinį serumą, kuriame yra antikūnų prieš gamaglobulino frakciją gyvūnų, iš kurių buvo gautas diagnostinis serumas, kraujo. Šviesos kompleksas aptinkamas fluorescencine mikroskopija.

Ryžiai. 7. Imunofluorescencinė reakcija (schema).

Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA) Fermentinis imunologinis tyrimas pagrįstas žinoma imunine antigeno ir antikūno reakcija. Vienas iš šių reagentų yra analitė, o kitas – atpažinimo reagentas, kurio standartinis specifiškumas (selektyvumas) analitės atžvilgiu yra žinomas. Jis naudojamas susidariusiems imuniniams kompleksams (antigenas-antikūnas) nustatyti fermentas, kuris preliminariai žymi atpažinimo komponentą (antigeną arba antikūną). Pats fermentas, žinoma, nėra matomas, todėl ELISA metodu nustatytos medžiagos buvimas vizualizuojamas naudojant tarpininką - chromogenas. Tai specialus cheminis junginys, kuris gerai tirpsta vandenyje, o tirpalas yra bespalvis. Bespalvio chromogeno pavertimas į spalvota medžiaga chromoforas atsiranda veikiant fermentui, kurio substratas yra chromogenas.

Ryžiai. 8. Fermentinis imunologinis tyrimas (schema).

Autoantigenai- medžiagos, kurios gali sukelti imuninės reakcijos organizme, iš kurio jie gaunami. Juose yra smegenys, akies lęšiukas, spermatozoidai, prieskydinės liaukos, sėklinės liaukos homogenatai, oda, inkstai, kepenys ir kiti audiniai. Kadangi normaliomis sąlygomis autoantigenai nesiliečia su imuninės sistemos antikūnai prieš tokias ląsteles ir audinius nesusidaro. Tačiau, kai šie audiniai yra pažeisti, autoantigenai gali būti absorbuojami ir sukelti antikūnų, turinčių žalingą poveikį atitinkamoms ląstelėms, susidarymą. Autoantigenai taip pat gali atsirasti iš tam tikrų organų ir audinių ląstelių, veikiant vėsinimui, vaistų poveikiui, virusinėms infekcijoms, bakterijų baltymams ir toksinams, tokiems kaip streptokokai, stafilokokai, mikobakterijos tuberkuliozė ir kiti veiksniai. Šiuo atveju jie susidaro dėl paties organizmo antigenų rūšies specifiškumo pažeidimo.

Antikūnai, būdami sudėtingos glikoproteinų molekulės, taip pat yra patys antigenai. Jų sudėtyje išskiriami trys antigeninių determinantų tipai (elitipai): izotipai, allotipai ir idiotipai.

Izotipai yra determinantai, išskiriantys sunkiųjų grandinių klases ir poklasius bei kappa ir lambda lengvųjų grandinių variantus.

Allotipai yra determinantai, užkoduoti tam tikro imunoglobulino geno alelių.

Idiotipai yra antigeniniai determinantai, suformuoti iš aktyvių antikūnų molekulių centrų.

IgG klasė sudaro apie 75% viso žmogaus serume esančių imunoglobulinų kiekio.